本发明涉及一种用于核酸酶检测的SERS横向流动试纸条及检测方法。所述SERS横向流动试纸条包括底板、样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫，反应膜设有检测线和控制线，检测线设置于靠近结合垫一端，控制线设置于靠近吸附垫一端；所述结合垫上包被有拉曼报告分子和检测DNA标记的纳米粒子作为SERS纳米探针，检测线固定有链霉亲和素，控制线固定抗单链DNA抗体。本发明以SERS技术进行定量分析，SERS信号强，无光漂泊，指纹信息丰富，稳定性强，故检测具有更高的灵敏度，与免疫层析技术结合制备成SERS横向流动试纸条，样本需求量低，操作简便，反应快速，结果准确，价格低廉，检出限低，选择性好，易于实现批量生产。