本发明涉及序列比较技术领域，具体为一种双序列比对工具评测方法、系统、设备和存储介质；为解决现有技术中工具评测结果效果差的技术问题，本发明设定当真实查询序列未知时，基于参考基因组，生成既服从对数正态分布读长特征，又能真实模拟实际测序数据错误分布特征的测序序列，用于形成双序列数据；当真实查询序列已知时，基于参考基因组和真实查询序列确定参考序列，用于形成双序列数据；最后将双序列数据输入至双序列比对工具中进行处理，并结合运行时间、峰值内存占用和准确度，来综合、准确地评估双序列比对工具的比对效果，公平地对比了不同双序列比对工具的性能，有助于选择在各自领域表现最优的双序列比对工具。